Państwowy Instytut Weterynaryjny - PIB

Celem badań było określenie przynależności gatunkowej oraz występowania genów warunkujących wytarzanie toksyn botulinowych (genów ntnh wspólnych dla wszystkich szczepów z rodzaju Clostridium zdolnych do produkcji toksyn botulinowych). Analizy były przeprowadzane przy zastosowaniu testu PCR do wykrywania genów 16S rRNA, następnie uzyskane produkty były poddawane sekwencjonowaniu Sanger’a. Odczytane sekwencje poddawano analizie przy zastosowaniu algorytmu BLAST (NCBI) w celu określenia ich podobieństwa do sekwencji zdeponowanych w bazie GenBank (NCBI). Z uzyskanych sekwencji skonstruowano także drzewo filogenetyczne przy zastosowaniu oprogramowania MEGA11. Przeprowadzone badania nie wykazały obecności genów ntnh świadczących o zdolności do wytwarzania toksyn botulinowych. Badane szczepy nie stanowiły zatem bezpośredniego niebezpieczeństwa epidemiologicznego związanego z potencjalną możliwością wywołania botulizmu. Analiza produktów 16S rRNA PCR wskazała, że najwięcej badanych szczepów wykazywało podobieństwo do gatunków C. sporogenes i C. tepidum. W grupach eksperymentalnych zaobserwowano obecność sekwencji podobnych do Paraclostridium benzolelyticum, C. cochlearium, [Para]Clostridium bifirmentans, Paeniclostridium sordelli. Gatunki te mogą posiadać zarówno cechy patogenne, ale jednocześnie niektóre szczepy mogą wykazywać cechy probiotyczne. Obecność wspomnianych sekwencji może być związana z wyższą liczbą Clostridium spp. odnotowywaną w jelitach pozyskanych od kurcząt skarmianych IPAP oraz większą różnorodnością genetyczną mikrobiomu beztlenowego.

Badania biochemiczne przeprowadzone przy zastosowaniu testów VITEK 2 ANC nie dały możliwości pełnej identyfikacji poddawanych badaniom izolatów. W większości testy te umożliwiały jedynie uzyskanie statusu „low discrimination” w grupach kontrolnych i eksperymentalnych (21 szczepów), co stanowiło niskie rozróżnienie gatunkowe. Spośród nich 15 wykazywało jednoczesne podobieństwo do gatunków: C. bifermentans, C. difficile, C. sporogenes jednocześnie w grupach kontrolnych i eksperymentalnych. Status „Excelent identification” uzyskały jedynie 3 szczepy, które zostały zidentyfikowane jako C. sporogenes. Realizacja działania naukowego umożliwiła wychwycenie pewnych różnic w składzie gatunkowym pomiędzy grupami kontrolnymi (grupy skarmiane paszami bez dodatku IPAP), a grupami eksperymentalnymi (grupy skarmiane paszami z dodatkiem IPAP). W szczególności wskazała na obecność szczepów Closridium spp., które mogą pozytywnie wpływać na dobrostan zwierząt. Wcześniejsze badanie ilościowe wskazało na wyższą liczbę Clostridium spp. w jelitach drobiu skarmianego paszami z udziałem IPAP. Wyniki badań uzyskane w ramach niniejszego działania wykazały większą różnorodność gatunkową w grupach eksperymentalnych w porównaniu z grupami kontrolnymi.

The aim of the study was to determine the species affiliation and the occurrence of genes determining the botulinum toxins production (ntnh genes common to all strains of the genus Clostridium capable of producing botulinum toxins). The analyzes were performed using a PCR test to detect 16S rRNA genes, then the obtained products were subjected to Sanger sequencing. The read sequences were analyzed using the BLAST algorithm (NCBI) to determine their similarity to sequences deposited in the GenBank database (NCBI). A phylogenetic tree was also constructed from the obtained sequences using MEGA11 software. The tests performed did not reveal the presence of ntnh genes indicating the ability to produce botulinum toxins. Therefore, the tested strains did not pose a direct epidemiological threat related to the potential to cause botulism. The analysis of 16S rRNA PCR products indicated that most of the tested strains were similar to C. sporogenes and C. tepidum species. The presence of sequences similar to Paraclostridium benzolelyticum, C. cochlearium, [Para]Clostridium bifirmentans, Paeniclostridium sordelli was observed in the experimental groups. These species may have been pathogenic, however at the same time some strains may have probiotic features. The presence of the mentioned sequences may be related to the higher number of Clostridium spp. recorded in the intestines obtained from IPAP-fed chickens and the greater genetic diversity of the anaerobic microbiome.

Biochemical tests performed using VITEK 2 ANC tests did not enable full identification of the tested isolates. For the most part, these tests only achieved “low discrimination” status in the control and experimental groups (21 strains), which represented low species discrimination. Of them, 15 showed similarity to the following species: C. bifermentans, C. difficile, C. sporogenes both in the control and experimental groups. Only 3 strains were identified as C. sporogenes and obtained the "Excelent identification" status. The implementation of the scientific activity made it possible to detect certain differences in species composition between control groups (groups fed with feed without the addition of IPAP) and experimental groups (groups fed with feed with the addition of IPAP). In particular, she pointed to the presence of Closridium spp. strains, which may have a positive impact on animal welfare. A previous quantitative study indicated a higher number of Clostridium spp. in the intestines of poultry fed with IPAP-containing feeds. The research results obtained as part of this activity showed greater species diversity in the experimental groups compared to the control groups.