Oprócz zmian genetycznych przyczyniających się do transformacji nowotworowej, w patogenezie nowotworów, w tym hematologicznych, obserwowane są zmiany wzoru metylacji DNA. Najbardziej dynamicznym procesem regulującym metylację DNA jest proces aktywnej demetylacji. W aktywną demetylację zaangażowane są białka TET, które katalizują utlenianie 5-metylocytozyny (5-mC) do 5-hydroksymetylocytozyny (5-hmC) oraz dalej do 5-formylocytozyny (5-fC) i 5-karboksylocytozyny (5-caC). Następnie na ścieżce naprawy typu BER z udziałem glikozylazy TDG dochodzi do usunięcia 5-fC oraz 5-caC i zastąpienia cytozyną, czego skutkiem jest demetylowany DNA. Białka TET1-3 są dioksygenazami zależnymi od α-ketoglutaranu i Fe(II) wymagającymi witaminy C jako dodatkowego kofaktora. Stwierdzono, że witamina C może zwiększać aktywność białek TET, a w efekcie odgrywać istotną rolę w procesach demetylacji. Wewnątrzkomórkowy poziom witaminy C może zależeć od jej sprawnego transportu do komórki za pośrednictwem Na+-zależnych transporterów witaminy C (SVCT1 i SVCT2), które są produktami odpowiednio genów: SLC23A1 i SLC23A2. SVCTs są zdolne do akumulacji witaminy C w komórce wbrew gradientowi stężeń. Stwierdzono, że endogenny poziom witaminy C w osoczu pacjentów z chorobą nowotworową jest niższy niż w grupie kontrolnej. W literaturze brak jest informacji na temat potencjalnych zależności pomiędzy stężeniem witaminy C w osoczu a jej zawartością wewnątrz komórek i poziomem produktów aktywnej demetylacji z udziałem TET. Ekspresja transporterów witaminy C w komórkach nowotworowych jest słabo udokumentowana. W ramach projektu postawiono następujące cele:
1) Czy poziom ekspresji transporterów witaminy C ma związek ze stężeniem witaminy C wewnątrz komórek?
2) Czy poziom witaminy C wewnątrz komórek ma wpływ na aktywność enzymów TET katalizujących powstawanie kluczowych produktów aktywnej demetylacji DNA, tj. 5-hydroksymetylocytozyny i jej pochodnych?
3) Czy istnieje związek pomiędzy skutecznością transportu witaminy C do komórki wyrażonego wewnątrzkomórkowym stężeniem witaminy C oraz poziomem produktów aktywnej demetylacji DNA a występowaniem nowotworów hematologicznych?
Materiał do badań stanowiły leukocyty krwi pozyskane od pacjentów z zespołem mielodysplastycznym (MDS), z ostrą białaczką szpikową (AML), z przewlekłą białaczką szpikową (CLL) przed i po suplementacji witaminą C w dawce 500mg/dzień oraz od osób z grupy kontrolnej, u których wykluczono zaburzenia hematologiczne. Ekspresję genów kodujących transportery witaminy C na poziomie mRNA oznaczono z wykorzystaniem techniki qRT-PCR, natomiast ekspresję na poziomie białka techniką Western Blot. Oznaczenia poziomu witaminy C oraz produktów aktywnej demetylacji DNA w leukocytach dokonano za pomocą systemu ultra sprawnej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (2DUPLC/MS/MS).
Wyniki badań przeprowadzonych w ramach projektu wskazują, że u pacjentów z ostrą i przewlekłą białaczką poziom witaminy C w osoczu krwi jest istotnie obniżony. Ponadto odnotowano niższy poziom ekspresji genu SLC23A2 w leukocytach pacjentów z AML w porównaniu z leukocytami osób grupy kontrolnej i z MDS. Zaobserwowano również niższy poziom wewnątrzkomórkowej witaminy C i 5-hydroksy-2'-deoksycytydyny (5-hmdC), kluczowego produktu demetylacji. W przypadku pacjentów CLL wykazano istotnie wyższą ekspresję genów SLC23A1 i SLC23A2 w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto w leukocytach pacjentów CLL odnotowano znamiennie obniżony poziom 5-hmdC, a zarazem podwyższony poziom 5-formylo-2'-deoksycytydyny. Jednak poziom witaminy C wewnątrzkomórkowej był znacząco wyższy w porównaniu do leukocytów grupy kontrolnej. Po 6 m-cach suplementacji witaminą C pacjentów CLL odnotowano istotny wzrost poziomu witaminy C w osoczu oraz wewnątrz komórki.
(2021)
